流式實驗如何配色

第一步，根據實驗目的，選擇目標Marker。

 通過閱讀相關文獻，了解您實驗需要選擇哪些Marker，以及這些Marker之間的邏輯關系（圈門的父子關系，比如T細胞CD3是“父”，而CD4或者CD8就是“子”）。

 這里列舉了一些常見的細胞標志Marker：

 

 

Human	Marker
B Cells	CD19
T Cells	CD3, CD4, CD8
Treg Cells	CD4, CD25, CD127
Th1/Th2/Th17 Cells	CD4, IFN-γ, IL-4, IL-17
Dendritic Cells	CD1c, CD83, CD141, CD209, MHC II
Natural Killer Cells	CD3-, CD16, CD56
Macrophage	CD11b, CD68, CD163
Monocyte	CD14, CD16, CD64
Plasma Cells	CD138
Red Blood Cells	CD235a

 

 

 

 

Mouse	Marker
B Cells	CD19
T Cells	CD3, CD4, CD8
Treg Cells	CD4, CD25, Foxp3
Th1/Th2/Th17 Cells	CD4, IFN-γ, IL-4, IL-17
Dendritic Cells	CD11c, MHC II
Natural Killer Cells	CD3-, CD49b (clone DX5) or NK1.1
Macrophage	F4/80, CD11b, CD80, CD86, CD206
Monocyte	CD11b, CD115, Gr-1, Ly-6C
Plasma Cells	CD138
Red Blood Cells	TER-119

 

 

 

 第二步，確認Marker的表達位置。

 對于細胞質或者細胞核的Marker，需要對細胞進行固定破膜/破核膜。在做胞質或胞核Marker染色實驗操作時，需要先染細胞表面Marker，再對細胞進行固定破膜，最后對胞內或核內Marker染色。此時細胞表面的Marker盡量避免使用串聯染料，因為“固定”容易對串聯熒光素造成影響。

 

 

 

 

一般來說，絕大部分CD分子指標，都是細胞表面指標；IL白介系列、IFN-γ、TNF-α等，屬于胞內指標；而最常見的核內染色指標是Foxp3。

 

確認Marker表達位置的同時，我們還需要了解Marker的表達量。前面提到過“強弱搭配”，我們需要通過表達量的強弱，來搭配熒光素的弱強。

 

通常，根據待測細胞類型中，相應抗原的表達量，可以粗略地將抗原分子分為三類：

 

01

很容易鑒定、容易區分陰陽性細胞群、陰陽性峰明顯分開的抗原。例如: CD3，CD4，CD19等。

02

很容易鑒定、較高水平表達、經常連續性表達。例如: CD27，CD28，CD45RA, CD45RO等。

03

低水平表達、激活性Marker、未知但關鍵。例如: CD25，STAT5，Foxp3等。

 

 

 

 

 

 

 

CD4

 

 

CD45RA

 

 

CD25

 

 

 

 

 表達量的強弱，可以參考廠家的質檢結果，但更多地需要參考文獻里具體細胞群體的表達。

 

第三步，了解實驗所用流式細胞儀的配置信息，包括：流式細胞儀的激光器、檢測通道和濾光片等。

 上期提到：流式細胞儀是同時檢測多種熒光的，這些熒光之間可能存在干擾。我們需要根據流式細胞儀的通道，來確認有哪些熒光素可以選擇，這樣可以在后期搭配的時候，盡量避免干擾。如果沒有儀器的通道信息，是無法去確定哪些熒光素可供選擇的。可以說，如果沒有儀器通道信息，配色就是“無源之水，無本之木”。

 

 通過儀器通道信息，確認可以選擇哪些熒光素后，我們還需要了解熒光素的信息，確認這些熒光素的激發波長和發射波長、接收該熒光的濾光片等信息，是否和流式細胞儀的通道一致。

 

 

 

 

 

 

 

 ▲ 常見熒光基團信息

 

 第四步，了解熒光素的強度。

 

 下表列出了常見熒光素的強度：

 

 

 

 在已確定Marker的強弱，和流式細胞儀可檢測的熒光素的強弱后，我們要遵循“強弱搭配原則”，進行配色。

 強表達抗原，可以選擇弱熒光素，也可以選擇強熒光素。

 如下圖所示，強表達抗原CD3，選擇弱熒光素FITC或強熒光素APC，對實驗結果影響不大。

 

 

 

 

 

 

 弱表達抗原，一定要選擇強熒光素。

 如下圖所示，弱表達的抗原CD25，選擇弱熒光素PerCP，會導致陰陽性細胞群分不開。如果選擇強熒光素PE，可以看到明顯的陽性細胞群。

 

 

 

 

 

 當然，有些老師在配色時，也會遇到一些其他的問題，如：細胞樣本有自發熒光、細胞處理容易出現死細胞（需要額外增加死活細胞染料）等。因此，我們需要特別注意，將對應通道的熒光檢測信息，預留給自發熒光，或者死活染料檢測。

 

 

 

 

 

 相信在了解了流式配色的基本原則及操作步驟后，大家的實驗也能更加順利地開展啦~

 配色是一個需要多因素考慮的工作，如果您在閱讀完本文后，具體操作時還是不清楚如何配色，歡迎填寫下面的配色服務需求表，我們的技術支持會給您提供專業的免費配色服務。

 

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